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細胞學堂 | 一文掌握骨髓來源巨噬細胞分離提取和培養(yǎng)

更新時間:2024-11-07  |  點擊率:151

巨噬細胞(Macrophages)是一種位于組織內的白血球,源自單核細胞,單核細胞來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞在生物體內扮演著多重角色,它們可以吞噬和清除異物和衰老死亡細胞、分泌生物活性物質、調節(jié)血細胞生成和參與免疫應答等,是一類在體內發(fā)揮重要免疫效應的細胞,并且也是實驗室最-常用的細胞種類之一。


骨髓來源巨噬細胞(Bone Marrow Derived Macrophage)是從大鼠或者其他哺乳動物骨髓中的單個核細胞經(jīng)細胞因子誘導分化得到的一種原代巨噬細胞。本期,我們將以大鼠為例,分享骨髓來源巨噬細胞分離提取和培養(yǎng)注意事項,幫助您順利上手開展實驗。

 分離提取步驟


一、分離脛骨和股骨



01

取2周齡的健康大鼠,斷頸法處死;

02

用超純水清洗大鼠2次,再用75%酒精浸泡5 min,進行表面除菌處理;

03

將消毒后的動物轉運至超凈工作臺內;

04

無菌條件下,用第一套無菌剪刀和鑷子剪開腿部皮膚,充分暴露兩側股骨;

05

更換第二套無菌剪刀和鑷子,從大腿根部關節(jié)處和腳后跟關節(jié)處剪斷,分離腿部肌肉,取出脛骨和股骨,將其放在含有PBS的培養(yǎng)皿內。

圖片

圖1. 分離的脛骨和股骨



二、沖洗骨髓


01

更換第三套無菌剪刀和鑷子,清理脛骨和股骨表面殘留的肌肉組織,注意保證骨頭完整;

02

留取純凈骨頭,將其轉移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內;

03

取一個新培養(yǎng)皿,加10 mL大鼠骨髓來源巨噬細胞完-全培養(yǎng)基(貨號CM-R141)備用;

04

更換第四套無菌剪刀和鑷子,先用鑷子固定骨頭,再用無菌剪刀剪下骨頭兩端;

05

用注射器吸取培養(yǎng)皿內的完-全培養(yǎng)基,從骨頭一端插入針頭,反復沖洗骨髓至骨頭發(fā)白透亮,將骨髓液收集在培養(yǎng)皿內;

06

用5 mL移液槍反復吹打骨髓液,將骨髓液經(jīng)200目細胞篩過濾,濾液收集于離心管內,離心棄上清,獲得骨髓細胞沉淀。

圖片

圖2. 注射器沖洗骨髓



三、巨噬細胞誘導分化


用含M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)的培養(yǎng)基刺激骨髓單個核細胞分化為巨噬細胞。

M-CSF有兩種獲取方式:

01

購買商品化的M-CSF因子(推薦貨號:PCK042、PCK043、PCK044、PCK303。M-CSF的常用濃度范圍為10-50 ng/mL,不同品牌的細胞因子使用濃度可能有所差異,需根據(jù)實際誘導效果調整使用濃度;

02

使用培養(yǎng)5-7天的L-929細胞上清[1]。將獲得的L-929細胞培養(yǎng)上清高速離心除雜,分裝后置于-20℃冷凍保存。通常使用含有20% L-929細胞上清的完-全培養(yǎng)基進行誘導,同時可根據(jù)實際誘導效果,調整L-929細胞上清的含量。

圖片

圖3. 誘導完成的骨髓來源巨噬細胞




細胞培養(yǎng)注意事項

骨髓來源巨噬細胞體外培養(yǎng)不增殖,需注意培養(yǎng)時間,建議盡快進行相關實驗;

骨髓來源巨噬細胞難消化,可用利多-卡因消化3 min左右(不建議超過5min),若細胞仍無法消化,更換消化液為0.25%胰蛋白酶,或使用無菌細胞刮。


參考文獻

[1] 

de Brito Monteiro L, Davanzo G G, de Aguiar C F, et al. M-CSF-and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes[J]. Immunobiology, 2020, 225(3): 151935.



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